【适度逆境】控制下针栽培法在花生有机种植中的应用

摘要

花生控制下针栽培法（AnM）3个重要环节包括：1. 播下种子比平常更深，诱使下胚轴伸长生长，播种后改土面扶平顶为尖形顶使截面看起来像“A”。2. 较正常情况更为伸长的胚轴，通过去除其表面的覆盖土，使得它暴露在光和空气干燥中，在这个时候，垄截面看起来像“n”。3. 在生长中期，为更适合花下针，将土壤自然堆向花生垄两侧，此时垄截面看起来像“M”形。AnM诱导渗透调节和通过升高子叶中的渗透压提高光合作用。花青素在下胚轴曝光开始后明显积累，并伴随着细胞内渗透调节物质的增多，如糖。Gdi-15在下胚轴中上调表达。AnM栽培法在土壤表面使用堆肥会更有效，因此，它在花生的有机种植生产中是可行的。

引言

AnM 花生栽培法采用沈毓骏教授于1988年提出的方法。三个字母：A、n、M是指在不同的阶段种植垄截面的形状。字母“A”为播下种子后垄截面的形状；小写字母“n”为苗期在去除土壤以暴露下胚轴后垄截面的形状；字母“M”全面开花阶段，为更适合花下针，将土壤自然堆向花生垄两侧，此时垄截面的形状。各类农艺优势表明AnM 栽培法提高了产量(沈毓骏 1985 年; 沈毓骏 1988 年)。然而，自从三十年前提出该种植方法后，关于产量提高的相关生理及分子生物学基础仍没有深入的研究。在这里，我们提出一个假设：AnM栽培法是旱生原理在植物生产上的应用。将下胚轴暴露在光照和干燥空气中是激活幼苗中抗旱及其他生理活性相关基因的关键因素。Gdi-15 是花生干燥诱导基因会被干旱信号激活 (Gopalakrishna 等人，2001 年)。因此，在本研究中设计了一个实验，不仅能从农艺性状和光合，还能从旱生调控原理如渗透压调节、保持膨压来说明AnM栽培法的优势。此外，另一项实验被设计来检测Gdi-15基因和它调控的生理活动。

试验材料和方法

实验1：花生 (Arachis hypogaea L. cv. Chibahandachi)生长在施用有机肥（N-52，P-30，K-20 g/kg）的田块中，其中有机肥发酵使用油渣、稻糠、鱼粉各200g/m²。如图,所示，深播种子距土面8cm，垄截面的形状像字母“A”。两个星期后移走幼苗周围的土壤，使胚轴暴露在光照和空气中，此时垄截面的形状像字母“n”。在全面开花时，将土壤堆向垄两侧使得更适合花下针，垄截面的形状像字母"M"。垄高20cm，植株间距为30cm，垄间距为60cm。大区设计为土壤表面堆肥，分成2 x 2个小区进行AnM栽培种植。使用Xu et al. (2011).的方法分析光合作用和渗透调节作用。实验2：使用实验1中一样的试验材料和水肥管理方法，但暴露下胚轴的时间为种子种下后1星期，在生长过程中只选用“n”阶段 。胚轴暴露在光强超过1200umol/m².s的中午。使用光谱测定花青素浓度。Real Time PCR(Applied Biosystems, USA)检测Gdi-15的基因表达量，按试剂盒（RNeasy Mini Kit (Qiagen, Tokyo, Japan)）中操作手册进行，cDNA合成试剂盒和SYBR® Premix Ex TaqTM II （TaKaRa, Japan）。引物：（F：5’-GGTGTTCCCATGATTGC-3’， R：5’-GCCTTGGTAGAAGAGCC-3’）。

结果

实验1：采用AnM栽培法的田块无论是使用生物堆肥还是不使用堆肥，产量都比对照高，且AnM配合生物堆肥效果很好。且产量高的田块中叶枯病发病程度低，叶片颜色和光合能力与产量成正比。AnM法栽培的植物叶片保持充分膨胀状态（πFT）时间更长的原因是，更多的活性溶质在叶片中积累。在AnM处理组中，在初始质壁分离时，叶片渗透势 (πIP) 和相对含水量 (ζIP) 比对照组要低，说明具有更高的抗逆性；在AnM处理组中植物细胞含水量(ζsym)也比对照要高，这可能会导致更多的生理活动。AnM栽培法在有土表堆肥的情况下会更有效。实验2：在暴露下胚轴的处理中，Gdi-15在花生幼苗阶段表达量升高（表2），花青素明显增多也同时说明了Gdi-15基因表达量的升高；同时，在本实验中，下胚轴暴露后花青素积累，是对干旱胁迫采取的保护措施。干旱响应基因Gdi-15只在暴露的下胚轴中被检测到表达量升高，而在如叶片和根部等组织中并没有变化。

表1. 在不同栽培方法下，花生的产量、病情指数、光合作用、渗透调节参数（实验1）

产量（kg/m²）；P_c,光合效率（μmol/m².s）；DI，病情指数（%）；L color,叶片颜色（SPAD）；P, π, ζ 和C分别表示，膨压（MPa），渗透势（MPa），叶片相对含水量和渗透浓度（osmol/m²）；下标FT、IP、sym分别表示完全膨胀状态、初始质壁分离、共质体水含量；* 和 ** 表示差异显著在p≥0.05和p≥0.01。

表2.Gdi-15的转录水平，花青素含量（实验2）

图1.花生控制下针栽培法（AnM）（左），花生芽下胚轴曝光后颜色变化（右）

讨论

花生AnM栽培法在中国已使用多年并效果显著，且农艺性状优势也已阐明(沈毓骏和 1988 年)。本研究发现，在花生苗下胚轴暴露处理后发现，共质体含水量增高、渗透浓度也增高从而导致叶片膨压升高。叶片保持高膨压状态，被认为是采用AnM栽培法增产的主要原因之一。其中关键点可能是由于暴露处理后，刺激信号被传送至细胞核内，激活抗性相关基因，转录和表达量升高，从而加强保护和抗逆性相关的生理活动。Gdi-15是干旱胁迫响应基因之一（Gopalakrishna et al. 2001），与花青素合成途径以及非生物胁迫适应性相关（Chervin et al. 2009）。在本次研究中，暴露处理后Gdi-15上调表达，花青素的明显积累也证明了Gdi-15的表达升高。在植物生理活动方面，叶片花青素在响应干旱、寒冷、高盐环境后会作为渗透调节物质加速合成，降低叶片渗透势，增加吸水量并保持叶片膨压，同时花青素还有UV屏障和清除胞内自由基的作用。胚轴颜色从白色到紫色的过程很可能与花青素含量变化相关，是旱生原理的典型表现（徐 2007）。虽然干旱不一定诱导花青素浓度变化，但含有花青素的植物组织往往对干旱胁迫具有抗性。Gdi-15被认为是典型的干旱应答基因（Gopalakrishna et al. 2001）。在生产实践中，下胚轴被暴露处理，但根部在充分潮湿的土壤中，实际上，暴露下胚轴并非是真的胁迫压力，而是一种刺激。干旱应答基因只在暴露的胚轴部分表达量升高，而在叶片和根部中无变化。然而，作为一种模拟胁迫，它成功的引起了干旱应答基因的表达升高，也正是旱生原理在作物上的引用。同时也证明了徐博士提出的旱生原理和信号转导在其他作物生产上的应用，如高粱中胚轴的暴露处理、大蒜种植中蒜瓣的处理、马铃薯根部的局部干燥处理、以及大棚种植番茄中照射蓝光。在大多数案例中，植物的根部处在潮湿的土壤中，并未受到水分胁迫，正如花生幼苗下胚轴暴露处理的情况一样。本研究证明， AnM栽培法中，暴露花生幼苗的下胚轴正是利用了旱生原理，有效的诱导了干旱应答基因的表达及其他生物量的变化。